Граммен бояу-бұл жылдам әдіс және тіндік үлгідегі бактериялардың болуын көру үшін және жасуша қабырғаларының химиялық және физикалық қасиеттеріне байланысты бактерияларды грам-оң немесе грам-теріс деп жіктеу үшін қолданылады. Грамды бояу әрдайым дерлік бактериялық инфекцияны диагностикалаудың алғашқы қадамы ретінде қолданылады.
Бояудың бұл әдісі дат ғалымы Ганс Кристиан Грамның (1853 - 1938) есімімен аталды, ол 1882 жылы техниканы жасап, оны 1884 жылы ұқсас клиникалық белгілері бар бактериялардың екі түрін ажырату әдісі ретінде шығарды: Streptococcus pneumoniae (сондай -ақ белгілі) Streptococcus pneumoniae). Pneumococci) және бактериялар Klebsiella pneumoniae.
Қадам
3 әдіс 1: микроскоп слайдын дайындау
Қадам 1. Зертханада жұмыс жасауға дайындал
Сіз сынап жатқан үлгінің бактериялық ластануын болдырмау үшін қолғап пен ұзын шашқа галстук киіңіз. Жұмыс орнын сорғыш астында немесе жақсы желдетілетін басқа жерде тазалаңыз. Бунзеннің қыздырғышын тексеріңіз және бастамас бұрын микроскоптың дұрыс жұмыс істейтініне көз жеткізіңіз.
Қадам 2. Микроскоп шыны слайдты зарарсыздандырыңыз
Егер шыны сырғытпа кір болса, май мен кірді кетіру үшін сабынды сумен жуыңыз. Слайдтарды этанолмен, әйнек тазартқышпен немесе зертхана қолданатын басқа әдіспен тазалаңыз.
Қадам 3. Үлгіні шыны сырғытпаға салыңыз
Медициналық үлгідегі бактерияларды немесе петри табағында өсетін бактериялар мәдениетін анықтауға көмектесу үшін Gram бояу әдісін қолдануға болады. Жақсы нәтижеге қол жеткізу үшін үлгінің жұқа штрихтарына Грам бояуын қолданыңыз. Жасы 24 сағаттан аз болатын үлгілерді қолданған жөн, өйткені ескі бактериялар жасуша қабырғаларын зақымдап, грам бояуына жауап бермеуі мүмкін.
- Егер тіндік үлгіні қолдансаңыз, шыны слайдқа 1-2 тамшы қосыңыз. Үлгі шашыратқыштың жұқа қабатын қалыптастыру үшін слайдқа біркелкі таратыңыз, оны басқа стерильді әйнек сырғытпасының жиегімен сырғытыңыз. Келесі қадамды жасамас бұрын оны құрғатыңыз.
- Егер сіз петри табақшасынан бактерияларды алсаңыз, Bunsen қыздырғышындағы егу циклін жарқырағанша зарарсыздандырыңыз, содан кейін оны суытыңыз. Слайдқа стерильді су тамызу үшін ілмекті қолданыңыз, содан кейін бактериялардың кішкене үлгісін алу үшін оны қолданар алдында зарарсыздандырып, қайтадан суытыңыз. Осыдан кейін ақырын араластырыңыз.
- Сорпада дайындалған бактерияларды құйынды көмегімен қайтадан араластыру керек, содан кейін жоғарыда көрсетілгендей егу циклімен су қоспастан алу керек.
- Егер сізде тампон үлгісі болса (әдетте мақталы ұсақ сабы бар), тампонды сырғытпаның үстіне тигізіп, ақырын айналдырыңыз.
Қадам 4. Аздап жоғары температура жақсы жағынды жасай алады
Жылу бактерияларды слайдтың үстінде ұстайды, сондықтан бояу процесінде олар оңай ерімейді. Слайдты Bunsen қыздырғышының үстінен екі -үш рет тез түртіңіз немесе слайдты электр жылытқышы арқылы қыздырыңыз. Қызып кетпеңіз, үлгі зақымдалуы мүмкін. Егер сіз Bunsen қыздырғышын қолдансаңыз, ол үлкен қызғылт сары жалынның орнына кішкентай, бірақ көк жалын болуы керек.
Сонымен қатар, құрғақ жағындыға 1-2 тамшы метанол қосып, метанолмен жағып, ашық метанолды ашық ауада қалдырып кептіруге болады. Бұл әдіс жасушаның зақымдалуын азайтады және слайдтың таза фонын қамтамасыз етеді
Қадам 5. Слайдты бояу науасының үстіне қойыңыз
Бояу табақшалары металдан, шыныдан немесе таяз пластиктен жасалған, үстіңгі жағы жұмсақ тормен қапталған. Слайдтарды осы торлардың үстіне қойыңыз, сонда сіз пайдаланатын сұйықтық науаға төгілуі мүмкін.
Егер бояу науасы болмаса, мұз текшелерін басып шығару үшін пластмассадан жасалған табаққа слайд қоюға болады
2 -ші әдіс 3: Gram Stain Process
Қадам 1. жағындыға күлгін кристалды сұйықтық құйыңыз
Пипеткамен бактериялардың үлгісін бірнеше тамшы кристалды күлгін бояумен шашыратыңыз, оны гентиян күлгін деп те атайды. Оны 30-60 секундқа қалдырыңыз. Кристалдық күлгін (КВ) сулы ерітіндіде КВ+ және хлорид (Cl-) иондарына бөлінеді. Бұл иондар грам-позитивті және грам-теріс бактериялардың жасуша қабырғалары мен мембраналарына енеді. КВ+ ионы бактериялар жасушаларының теріс зарядталған компоненттерімен әрекеттесіп, жасушаларға күлгін түс береді.
Көптеген зертханаларда жауын -шашынның алдын алу үшін аммоний оксалаты бар «Хакер» кристалды күлгіні қолданылады
Қадам 2. Кристалл күлгінді ақырын шайыңыз
Слайдты еңкейтіп, жуғыш бөтелкені қолданып, тазартылған немесе ағынды сулардың кішкене ағынын сырғытпаға шашыратыңыз. Су жағынды бетіне ағып кетуі керек және оны жағындыға тікелей шашпау керек. Шамадан тыс шаюға болмайды. Ол грам -позитивті бактериялардың бояуын кетіре алады.
Қадам 3. Жағынды йодпен шайыңыз, содан кейін шайыңыз
Жағынды йодпен жуу үшін тамшылатқышты қолданыңыз. Оны кемінде 60 секунд ұстаңыз, содан кейін жоғарыдағыдай мұқият шайыңыз. Иод теріс зарядталған ион түрінде КВ+ -мен әрекеттесіп, Кристалл шегіргүл пен йод арасында үлкен қосылыс комплексін құрайды (CV-I күрделі комплексі)) жасушаның ішкі және сыртқы қабаттарында. Бұл қосылыстар кешені кристалды шегіргүлдің күлгін түстерін жасушаның ішінде, боялған жерлерде сақтайды.
Йод - агрессивті зат. Ингаляциядан, жұтудан немесе теріге тиіп кетуден аулақ болыңыз
Қадам 4. Түс ағартқышты қосыңыз, содан кейін тез шайыңыз
Әдетте бұл маңызды қадам үшін ацетон мен этанолдың 1: 1 қоспасы қолданылады, оны мұқият уақытпен белгілеу керек. Слайдты белгілі бір бұрышқа қойыңыз, содан кейін шаюға қолданылатын суда күлгін түс пайда болмайынша түс ағартқышты қосыңыз. Бұл әдетте 10 секундтан аз уақыт алады, немесе ағартқышта ацетонның жоғары концентрациясы болса, одан да аз уақыт кетеді. Бұл қадамды дереу тоқтатыңыз, әйтпесе бояғыш грам-позитивті және теріс жасушалардан кристалды күлгінді шығарады, бояу процесін қайталау қажет. Бұрынғы техниканы қолданып, артық түсті ағартқышты бірден шайыңыз.
- Таза ацетон (95%+) алмастырғыш ретінде қолданыла алады. Ацетонды көп қолданған сайын ағартқыш тезірек жұмыс істейді, сондықтан уақытқа көбірек көңіл бөлу қажет.
- Егер сіз осы қадамның уақытын қадағалай алмайтын болсаңыз, түс ағартқышты тамшылатып қосыңыз.
Қадам 5. Қарсы бояуды жағындыға себіңіз, содан кейін шайыңыз
Түссізденген (түссізденген) бактерияларды, яғни қызғылт немесе қызыл түске бояу арқылы грамтеріс пен грамоң бактериялар арасындағы контрастты жоғарылату үшін қарсы бояу, әдетте сафранин немесе фуксин қолданылады. Кем дегенде 45 секундқа қалдырыңыз, содан кейін шайыңыз.
Фуксин көптеген грамтеріс бактерияларды қарқынды бояйды, мысалы Haemophilus spp және Legionella spp. Бұл әдіс жаңадан бастаушыларға жақсы
Қадам 6. Слайдты құрғатыңыз
Сіз оларды кептіру үшін ашық ауада кептіре аласыз немесе осы мақсатта сатылатын библиялық қағазды пайдаланып кептіре аласыз. Граммен бояу процесі аяқталды.
3 -ші әдіс 3: Бояу нәтижелерін тексеру
Қадам 1. Жарық микроскопын дайындаңыз
Слайдты микроскоптың астына қойыңыз. Бактериялар мөлшері бойынша әр түрлі болады, сондықтан жалпы ұлғайту 400x -тен 1000х -қа дейін өзгереді. Кескіннің айқын болуы үшін суға батырылған майы бар объективті линза ұсынылады. Көпіршіктердің пайда болуын болдырмау үшін тамшылатып жатқанда қозғалмаңыз, суға түсетін майды слайдқа тастаңыз. Объективті линза орнына түсіп, майға тиіп кететіндей етіп микроскоп линзасының тұтқасын жылжытыңыз.
Майға батыруды «құрғақ» линзаларға емес, арнайы жасалған линзаларға ғана қолдануға болады
Қадам 2. Грам оң және грамтеріс бактерияларды анықтауға тырысыңыз
Слайдты жарық микроскопымен қарап шығыңыз. Грам-позитивті бактериялар күлгін түске боялады, өйткені кристалды күлгін жасушаның қалың қабырғасында қалады. Грам-теріс бактериялар қызғылт немесе қызыл болады, өйткені кристалды күлгін жұқа жасуша қабырғалары арқылы жуылады, онда қызғылт қарсы бояғыш енеді.
- Егер үлгі тым қалың болса, нәтиже жалған оң болуы мүмкін. Нәтиженің дұрыс екеніне көз жеткізу үшін барлық грам -позитивті бактериялар болса, жаңа үлгіні бояңыз.
- Егер сіз түс ағартқышты тым көп қолдансаңыз, нәтиже жалған теріс болуы мүмкін. Нәтиженің дұрыс екеніне көз жеткізу үшін, егер барлық грамтеріс бактериялар болса, жаңа үлгіні бояңыз.
Қадам 3. Сіз көрген нәтижелерді анықтамалық кескінмен салыстырыңыз
Егер сіз бактериялардың қалай көрінетінін білмесеңіз, әдетте пішіні мен грам түсі бойынша сұрыпталған анықтамалық суреттер жинағын зерттеңіз. Сіз сондай -ақ [Ұлттық микробтық патогендер дерекқоры, фотосуреттердегі бактериялар және басқа да көптеген онлайн -сайттарда онлайн дерекқорларды көре аласыз. Сәйкестендіруді жеңілдету үшін төменде диаграмма үшін жиі кездесетін немесе маңызды болып табылатын бактериялардың мысалдары келтірілген, олардың статусы мен формасына сәйкес жіктеледі.
Қадам 4. Грам-позитивті бактерияларды пішініне қарай анықтаңыз
Микроскоп астында пішініне қарай бактериялар жіктеледі, көбінесе кокктар (сфералық) немесе таяқшалар (цилиндрлік). Міне пішініне қарай грам-позитивті бактериялардың (күлгін түсті) кейбір мысалдары:
- Грам позитивті кокс әдетте стафилококктар (топтық кокктерді білдіреді) немесе стрептококктар (тізбекті кокктерді білдіреді).
- Bacillus, Clostridium, Corynebacterium және Listeria сияқты грам оң таяқшалар. Таяқша бактериялар Actinomyces spp. әдетте бұтақтары немесе жіпшелері болады.
5 -қадам. Грам теріс бактерияларды анықтаңыз
Грам-теріс бактериялар (қызғылт түсті) жиі үш топқа жіктеледі. Коккалардың пішіні шар тәрізді, таяқшалары ұзын және жіңішке, ал коккоидты таяқшалар арасында.
- Грам теріс кокктар Ең жиі кездесетіні - Neisseria spp.
- Грам-теріс таяқшалар мысалы, E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas және т.б. Тырысқақ вибрионы тұрақты сабақ немесе майысқан сабақ ретінде көрінуі мүмкін.
- Грам-теріс «коккоид» (немесе «коккобакилли») таяқша бактериялары мысалы, Бордетелла, Бруцелла, Гемофил және Пастерелла
Қадам 6. Нәтижелер аралас болғанын мұқият тексеріңіз
Кейбір бактериялардың жасушалық қабырғаларының сынғыштығына немесе балауыздығына байланысты дәл бояуы қиын. Бұл бактериялар бір жасушада немесе бір жағындыда әр түрлі жасушалар арасында күлгін немесе қызғылт түсті қоспаны көрсетуі мүмкін. 24 сағаттан асқан бактериялық үлгілер бұл мәселені көрсетуі мүмкін, бірақ сонымен қатар кез келген іріктеу жасында бояуы қиын болып қалатын кейбір бактериялық түрлер бар. Бұл бактериялар қышқылға тез бояу, бактериялық культурада бақылау, TSI культуралық ортасы немесе генетикалық тестілеу сияқты сәйкестендіру үшін арнайы тесттерді қажет етеді.
- Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium және Propionibacterium spp. барлығы грам-позитивті бактериялар, бірақ көбінесе айқын боялмаған.
- Treponema, Chlamydia және Rickettsia spp сияқты ұсақ, жұқа бактериялар. Грам әдісімен бояу қиын.
Қадам 7. Қалған шығын материалдары мен жабдықтарды тастаңыз
Қалдықтарды жоюдың бұл процедурасы зертханаларда әр түрлі болады және қолданылатын материалдарға байланысты. Әдетте бояу науасындағы сұйықтық қауіпті қалдықтар деп белгіленген бөтелкелерге тасталады. Слайдтарды 10% ағартқыш ерітіндісіне салыңыз, содан кейін өткір контейнерге тастаңыз.
Кеңестер
- Есіңізде болсын, Gram бояу нәтижесі үлгі жақсы болған жағдайда ғана жақсы болады. Пациенттерге олар жақсы үлгі бере алатындай етіп хабарлау маңызды (мысалы, қақырық үлгісін алу үшін түкіру мен терең жөтел арасындағы айырмашылық).
- Түсті ағартқыш ретінде этанол ацетонға қарағанда баяу әрекет етеді.
- Қауіпсіздікті қамтамасыз ету үшін стандартты зертханалық ережелерді сақтаңыз.
- Жаттығу үшін щетканы қолданыңыз, себебі құрамында грам-оң және грам-теріс бактериялар бар. Егер сіз бактериялардың бір түрін көрсеңіз, сіз ағартқышты тым аз немесе тым көп қолданған боларсыз.
- Слайдты бекіту үшін ағаш ілгектерді қолдануға болады.
Ескерту
- Ацетон мен этанол - тез тұтанатын заттар. Ацетон сіздің қолыңыздағы майды кетіреді, бұл сіздің теріңізге басқа химиялық заттарды сіңіруді жеңілдетеді. Қолғап киіңіз және оларды абайлап қолданыңыз.
- Грам бояуын немесе қарсы бояуды шаймас бұрын жағынды құрғатпаңыз.
Сізге не керек
- Желі үлгісі
- Шыны слайд
- Пипетка
- Шағын от көзі, немесе жылытқыш немесе метанол
- Су
- Хрусталь күлгін
- Йод
- Түсті ағартқыш, мысалы, алкоголь немесе ацетон
- Сафранин
